1. Odczytywanie wyników.
Po zakończeniu analizy w panelu Klienta, w zakładce moje analizy umieszczone zostaną pliki w formacie .seq oraz .ab1 dla każdej z analizowanych próbek, jak również 2 pliki skompresowane w formacie .rar zawierające spakowane wszystkie wyniki z danej analizy w formacie .seq i .ab1.
Do odczytu wyników przedstawionych w formie dokumentu tekstowego zawierającego sekwencję oraz fluorogramu w formacie .seq lub .ab1 służą m.in. dedykowane programy specjalistyczne FinchTV lub BioEdit.
Poniższa informacja ma pomóc w prawidłowym odczytaniu wyników. Otrzymany w postaci pliku graficznego wynik analizy nie zawsze ma idealny wygląd. Różne odstępstwa od prawidłowego wyglądu chromatogramu, które nie wpływają na prawidłowość odczytu są opisane poniżej.
1.1. Prawidłowy wygląd chromatogramu
a. Chromatogram idealny
Poniżej znajduje się przykład idealnego chromatogramu pozbawionego szumów i tzw. dye blobów – jest to chromatogram o odpowiedniej rozdzielczości.
rys. 1
b. Chromatogram prawidłowy, ale z szumem tła
Przykład chromatogramu z szumem tła, jednakże pozwalającego na prawidłowy odczyt. Szum jest na tyle mały, że sekwencję można odczytać bezbłędnie:
rys. 2
Odczyt pierwszych 20 nukleotydów w chromatogramie może być nieprawidłowy. Jest to stan zupełnie normalny związany z charakterystyką używanych barwników fluorescencyjnych. Dlatego taki obraz początku chromatogramu, jak przedstawiony na rys. 3 nie stanowi błędu.
rys. 3
c. Dopuszczalne zaburzenia występujące w chromatogramie
Dopuszczalny spadek rozdzielczości nie wpływający negatywnie na odczyt sekwencji. Kluczowa jest zauważalna separacja pików odpowiadających poszczególnym nukleotydom:
rys. 4
d. Heterozygoty
Heterozygoty występują naturalnie w DNA i nie są związane z nieprawidłowo wykonanym sekwencjonowaniem. Przykład heterozygoty SNP (single nucleotide polymorphism) obrazuje rys. 5.
rys. 5
1.2. Kiedy powtarzać analizę danej próbki?
Niekiedy odczyt jest na tyle niejednoznaczny, że może rodzić konieczność ponownego wykonania analizy. W takim przypadku w terminie 10 dni od przekazania wyników analizy Klientowi przysługuje możliwość skorzystania z opcji „zleć powtórną analizę” w oparciu o nadesłany wcześniej materiał. Jedna powtórka wykonania analizy w przypadku zajścia któregoś z opisanych niżej zdarzeń uniemożliwiających odczyt jest bezpłatna. W sytuacji gdy powtórna analiza nie da prawidłowego wyniku konieczne będzie ponownie przesłanie produktu wraz ze starterami, jako kolejnego zamówienia.
Poniżej opisane są przykładowe sytuacje związane z nieprawidłowym odczytem, tj.:
- Zbyt duży szum tła
- Dye blob
- Spadek rozdzielczości chromatogramu uniemożliwiający prawidłowe odczytanie sekwencji
a. Zbyt duży szum tła
Przykład chromatogramu z dużym szumem tła (rys. 6), które nie pozwala na prawidłowy odczyt. Powodem takiego stanu rzeczy może być dostarczenie niskiej jakości próbki, próbki z więcej niż jednym produktem lub zużyciem kapilary sekwenatora.
rys. 6
b. Dye blob
Dye blob, spowodowany jest nieprawidłowym oczyszczeniem próbki z barwnika fluorescencyjnego. Jeżeli dye blob występuje w miejscu interesującej nas sekwencji, sekwencjonowanie należy powtórzyć. Taką sytuację ilustruje kolejny obraz:
rys. 7
c. Spadek rozdzielczości chromatogramu uniemożliwiający prawidłowe odczytanie sekwencji
Spadek rozdzielczości uniemożliwiający prawidłowe odczytanie sekwencji ilustruje poniższa grafika.
rys. 8
2. Potencjalne źródła problemów.
W przypadku, gdy reakcja sekwencjonowania nie daje satysfakcjonujących rezultatów, tj. prawidłowego odczytu, oferujemy możliwość jej jednokrotnego powtórzenia bez dodatkowych opłat.
W niektórych przypadkach, taka powtórna reakcja da prawidłowy wynik, co rodzi pytanie o przyczynę takiego stanu rzeczy. Najbardziej prawdopodobne powody, dla których powtórzona reakcja daje lepsze, czy wręcz idealne dane są następujące:
- Pierwotna reakcja nie zaszła wcale lub też nie powiodła się za sprawą błędu ludzkiego. Przykładowo:
- primer (starter) nie przyłączył się odpowiednio do wektora.
- zaszły błędy przy procesie PCR w laboratorium
Powtórna reakcja dała prawidłowy odczyt.
- W większości przypadków powtórna reakcja nie jest dokonywana w sposób identyczny jak pierwsza. Zanim się jej podejmiemy, przeglądamy nieudane wyniki poprzednie reakcji, badamy ilość użytego DNA i rodzaj wykorzystanych starterów. Następnie próbujemy określić w jaki sposób zmienić parametry reakcji tak, by osiągnąć lepszy rezultat. Można to osiągnąć np. poprzez:
- Rozcieńczenie stężenia próbki.
- Zmianę ilości użytego DNA i / lub starterów
- użycie innego odczynnika (jak np. DMSO)
- inne sposoby możliwe do zastosowania w celu poprawy uzyskanych wyników
Ma to zastosowanie szczególnie w odniesieniu do próbek pochodzących od nowych klientów. Poznanie specyfiki różnych próbek przesyłanych z różnych laboratorium może być procesem wymagającym czasu na optymalizację.
3. Pomoc w interpretacji wyników sekwencjonowania.
- Firma NEXBIO oferuje wsparcie w zakresie interpretacji wyników sekwencjonowania, w tym m.in.:
- odczyt chromatogramów,
- składanie sekwencji w pojedynczy kontig,
- porównaniu sekwencji z wielu próbek między sobą, sekwencją wzorcową
- analiza bioinformatyczna wyników
- W celu zlecenia usługi interpretacji wyników sekwencjonowania prosimy o kontakt mailowy lub telefoniczny
- Dla usprawnienia procedury zalecamy, aby zawrzeć w mailu następujące informacje pomocnicze:
- Rodzaj interpretacji: analiza międzygatunkowa, analiza filogenetyczna, analiza w obrębie jednego gatunku itp.
- Rodzaj analizowanej zmienności: VNTR, SNP, insercja, delecja itp.
- Rodzaj i gatunek identyfikowanego organizmu.